CARNE COLTIVATA E ORGANI ARTIFICIALI

BIOCHEMICAL REACTORS AND THEIR ROLE IN SYNTHETIC MEATAND ORGANS PRODUCTION: 

Fixed bed vs Microcarriers, Air-lift and hollow fiber reactors for upscaling cultured production 

Che cosa sono i reattori biochimici? - What Biochemical Reactors are?

Sono dispositivi utilizzati per coltivare e mantenere viventi le cellule in un ambiente controllato in cui possono crescere e moltiplicarsi. Essi forniscono i nutrienti e le sostanze chimiche necessarie per la crescita, come aminoacidi, vitamine e minerali. Quindi essi sostengono e supportano la vita di cellule e colture tessutali con il vantaggio di usare condizioni miti e alti rendimenti, essendo che tutte le reazioni sono catalizzate dagli enzimi. DEFINIZIONE: Insieme di pratiche che consentono la creazione di sostanze e microrganismi, nonché la fornitura di servizi come depurazione e analisi, mediante l'utilizzo di organismi viventi, i loro enzimi e i loro costituenti. 

La storia delle biotecnologie - History of biothecnologies 

Un utilizzo inconsapevole delle biotecnologie deriva dalle civiltà dei Sumeri e dei Babilonesi, che fin dal 6000 a.C. producevano birra attraverso il processo di fermentazione con il lievito, seguiti dagli Egizi che iniziarono a far lievitare il pane. 

Solo nel 1800, con l'avvento del microscopio, Pasteur descrisse il legame tra i processi fermentativi e microrganismi specifici e Buchner poi scoprì che la fermentazione poteva avvenire con estratti di lievito privi di cellule viventi, evidenziando l'importanza degli enzimi. 

L'uso industriale delle fermentazioni prese piede nei primi decenni del XX secolo con tentativi di produzione di etanolo, acetone, glicerina, butanolo ed acido citrico, ma dopo la 2^ Guerra Mondiale molti processi furono abbandonati a causa della disponibilità di petrolio e dell'antieconomicità rispetto alle sintesi chimiche. 

Solo successivamente con l'era degli antibiotici (con la scoperta della penicillina isolata da Fleming) e la produzione di insulina umana si fecero concreti passi avanti nella realizzazione di tali processi. 

Come funzionano i reattori biochimici? - How Biochemical Reactors work? 

Questi reattori sono progettati per fornire le condizioni ideali per la coltivazione delle cellule muscolari. Queste includono la temperatura, l'umidità, la concentrazione di nutrienti e la presenza di ossigeno. Per esempio la coltura delle cellule di mammifero avviene regolarmente a 37 °C, mentre la coltura delle cellule di pesce viene mantenuta nell'intervallo di temperatura compreso tra 15 e 30 °C. Pertanto, per evitare perdite di produzione, è necessario il controllo della temperatura di processo nell'intervallo 10–40 °C con una precisione inferiore a 0,5 °C. 

Sostenibilità - Sustainability

Nonostante la lunga storia della chimica nell'inventare prodotti con prestazioni straordinarie, il progresso tecnologico spesso ha trascurato le conseguenze avverse e spesso nella mente della popolazione, la chimica è più frequentemente associata all’inquinamento. Per raggiungere una società sostenibile, è necessario progettare prodotti e processi conformi a principi compatibili con la vita.

Le proprietà intrinseche delle molecole devono essere considerate fin dalla fase di progettazione, valutando se composti e processi sono esauribili o rinnovabili, persistenti o degradabili, tossici o innocui. La questione cruciale non è se i prodotti dell'industria saranno indispensabili, ma piuttosto quali saranno le caratteristiche, la natura e i processi di produzione dei prodotti sintetici necessari per una civiltà sostenibile.

Il settore dell'allevamento è responsabile dell'18% delle emissioni di gas serra e dell'8% del consumo umano di acqua e le previsioni di un aumento della popolazione mondiale e del consumo di carne spingono la ricerca a trovare alternative. 

In aggiunta nel 2017 uno studio dei ricercatori dell'Istituto Pasteur di Parigi evidenzia come la resistenza alle penicilline sia nata dall'abuso negli allevamenti negli anni '50.Le attuali tendenze indicano un possibile ritorno alle condizioni pre-antibiotici, con ferite letali e proceduremediche rischiose. Ogni anno, almeno 700.000 persone muoiono a causa di malattie legate a batteri resistenti ai farmaci e l'ONU stima che dal 2050 si potrebbero verificare oltre 10 milioni di morti all'anno, con costi superiori a 100 trilioni di dollari. Entro il 2050, i batteri resistenti agli antibiotici potrebbero diventare la principale causa di morte, con una previsione di un decesso ogni 3 secondi. 

La storia della carne sintetica - History of cultured meat 

Il concetto di carne coltivata in vitro, sebbene sembri una novità, è presente nell'immaginario collettivo da oltre 100 anni. Frederick Edwin Smith menzionò per la prima volta questa idea, predicendo la possibilità di produrla utilizzando il materiale ottenuto da un singolo filetto, ma solo nel 1971 si ebbe la prima coltivazione di fibre muscolari, ottenuta dall'aorta di un porcellino d'India da Russel Ross. 

Nel 1991, Jon F.Vein presentò una domanda di brevetto per la produzione di carne ingegnerizzata per il consumo umano, assumendo la produzione simultanea di tessuti muscolari e grassi per mantenere una composizione simile a quella della carne animale. Inoltre, nel 2001, ricercatori dell'Università di Amsterdam presentarono un brevetto per un processo di produzione di carne in vitro, utilizzando una matrice di collagene seminata con cellule muscolari e sospesa in un mezzo. 

Il primo grande investimento nella ricerca fu dalla NASA, in cui gli scienziati coltivarono tessuto muscolare dal comune pesce rosso in piastre Petri, con l'obiettivo di produrre proteine muscolari animali per viaggi spaziali a lungo termine. 

Quindi, la produzione di carne in vitro è un processo a più fasi che inizia con l’isolamento delle cellule miosatelliti (cellule staminali muscolari) da un campione di tessuto animale. Quando vengono poste in un terreno di coltura di proliferazione, le cellule diventano mioblasti proliferativi che aumentano di numero e di biomassa (fase di crescita cellulare).

 Successivamente, il terreno viene cambiato per indurre la differenziazione dei mioblasti in miociti non proliferativi che si fondono in miotubi multinucleati e quindi in fibre muscolari commestibili (Mattick et al., 2015). 

Crescita cellulare - Cellular grow

1. La fase di lag è caratterizzata da un adattamento alle condizioni del reattore, con un aumento minimo della concentrazione cellulare e la replicazione del materiale genetico delle cellule.  

2. Nella fase di crescita esponenziale, il tasso di crescita cellulare è proporzionale alla concentrazione cellulare e le cellule utilizzano efficientemente i nutrienti.  

3. La fase stazionaria è raggiunta quando le cellule raggiungono uno spazio biologico minimo in cui la mancanza di uno o più nutrienti limita la crescita; c'è un equilibrio tra cellule formate e morte.  

4. Infine, nella fase morta si verifica una diminuzione della concentrazione di cellule vive, causata dai sottoprodotti tossici, ambienti difficili e/o esaurimento dell'apporto di nutrienti. 

Tre principali modi di operazione:

 Batch: contiene un volume di terreno di coltura fisso, consentendo alle cellule di proliferare fino a raggiungere la massima densità, dopodiché devono essere trasferite in un altro bioreattore più grande. 

Semi-batch: consente l'alimentazione di porzioni aggiuntive di terreno di coltura attraverso un ingresso dedicato, solitamente a intervalli di tempo prestabiliti, calcolati per raggiungere la massima proliferazione. Poiché in questo tipo di reattore non è presente un canale di uscita per il terreno di coltura esausto, il volume della coltura aumenta nel tempo, raggiungendo eventualmente la capacità massima. 

Continui: somministrazione continua di terreno di coltura a un flusso costante, con contemporanea rimozione del terreno di coltura esausto, dei prodotti di scarto cellulari e delle cellule formate. Questo tipo dovrebbe consentire tecnicamente i tassi di crescita cellulare più ottimizzati, grazie al mantenimento relativamente costante dei livelli di nutrienti e del numero di cellule. Reattori di perfusione: un sottotipo, si basa sullo scambio di terreno di coltura senza disturbare il contenuto cellulare dei reattori, il che consente di ottenere il massimo riciclo del terreno di coltura. 

Nel campo della biofarmaceutica, i bioreattori classici agitati (Stirred Tank) sono stati utilizzati per la produzione di cellule animali in volumi fino a 20.000 litri. Tuttavia, questi non sono sufficienti per la carne coltivata, la quale deve raggiungere volumi di produzione più simili a quelli delle industrie alimentari e zootecniche. 

I reattori ad aria ascensionale (Air-lift reactors) permettono anche la crescita in sospensione e diventano vantaggiosi a scale molto grandi (>300.000 L), poiché la loro miscelazione non coinvolge parti in movimento, riducendo l'omogeneità, lo stress da taglio, i gradienti di nutrienti o ossigeno e i requisiti energetici per la miscelazione. 

Sforzo da taglio - Shear stress

Lo sforzo da taglio è la forza meccanica indotta dall'attrito del liquido sulla superficie delle cellule. Le cellule animali sono generalmente più suscettibili rispetto ai loro omologhi microbici a causa della mancanza di parete cellulare. In un bioreattore, lo stress da taglio può essere causato dalla turbolenza del liquido generata dall'agitatore (o dal movimento generale) per mantenere le cellule in sospensione. Volumi più grandi generalmente implicano forze di taglio più forti, anche se la forza è non omogenea e possono essere generati multipli vortici di turbolenza a seconda del tipo e del numero di agitatori. Lo stress da taglio può mitigato mediante l'installazione di interruttori di flusso. Anche la presenza di bolle e la loro rottura generano shear stress a causa delle differenze nelle velocità di scorrimento. Nelle cellule cresciute in sospensione, bolle < 1 mm di diametro, si hanno shear stress elevati e tassi di citotossicità più alti, ma ciò può essere compensato facendo crescere le cellule su dei supporti. 

Le cellule nel loro ambiente naturale sono in costante contatto tra loro, trasmettendo segnali, metaboliti e informazioni rendendo possibile la vita. Per mantenere questo contatto, è essenziale una relazione spaziale, e la matrice extracellulare (ECM) è fortemente coinvolta in questo processo. Nelle colture cellulari, molti tipi di cellule mostrano forti proprietà adesive, sfruttate nelle colture in sospensione, su impalcature o utilizzando microcarriers. 

Un'impalcatura è un materiale biocompatibile che può sostenere la crescita delle cellule aderenti attraverso il supporto meccanico, facilitando una perfusione del mezzo più semplice e dirigendo la formazione del modello tissutale. Inoltre, dato che il prodotto finale è commestibile, i materiali utilizzati dovrebbero essere non tossici (come dal minerale idrossiapatite) e biodegradabili (come cellulosa, collagene, gelatina, alginato, chitosano, acido poli (lattico-co-glicolico) (PLGA), polilattide (PLA)) 

Coltura in Reattori a Letto Fisso 

1. Le cellule aderiscono e crescono su una superficie fissa 

2. Presenta sfide nel fornire un ambiente 3D alle cellule. 

3. Più difficile controllare e monitorare rispetto ai microcarriers, con potenziali problemi di omogeneità della coltura. 

Coltura su Microcarriers (MCs) 

1. Le cellule crescono su "perle" sospese nel mezzo di coltura in un ambiente 3D. 

2. Offre un'ampia superficie/volume, favorendo l'ingrandimento, con un intervallo di 100–300 µm di diametro 

3. Facilità di controllo e monitoraggio contribuendo a una maggiore qualità e consistenza del prodotto. Il rivestimento della superficie dei MC con proteine della matrice extracellulare (ECM), come collagene, laminina, fibronectina o vitronectina non solo ha il vantaggio di migliorare l'attaccamento, ma fornisce anche un ambiente più simile a quello in vivo, con conseguente mantenimento della funzionalità cellulare e della capacità di differenziazione 

Reattori a fibra cava - Hollow fiber reactors 

Un altro metodo è usare bioreattori a fibra cava selezionati per il loro design compatto e i vantaggi che ne derivano in termini di spazio ridotto, utilizzo di acciaio inossidabile e requisiti di pulizia e sterilizzazione rispetto ad altre configurazioni per unità di prodotto (coltivare cellule a 1–2 × 10^8 cellule/mL).

E' un sistema di coltura cellulare tridimensionale basato su membrane capillari semipermeabili, fibre cave, disposte in serie parallela con un tipico intervallo di cut-off del peso molecolare (MWCO) di 10-30 kDa. Queste membrane sono raggruppate e contenute all'interno di gusci tubolari in policarbonato per creare cartucce di bioreattori a fibra cava. 

All'interno di tali cartucce, che sono dotate di porte di ingresso e uscita, si trovano due compartimenti principali: lo spazio intracapillare (IC) all'interno delle fibre cave e lo spazio extracapillare (EC) che le circonda. Le cellule vengono seminate nello spazio EC e si espandono in questo ambiente. Il terreno di coltura cellulare viene pompato attraverso lo spazio IC, fornendo ossigeno e nutrienti alle cellule mediante la perfusione della membrana a fibra cava. 

Con l'espansione delle cellule, i prodotti di scarto e la CO2 permeano le membrane a fibra cava e vengono rimossi dal flusso del terreno di coltura attraverso lo spazio intracapillare. Con l'accumulo di prodotti di scarto a causa dell'aumento della massa cellulare, la velocità del flusso del terreno di coltura può essere aumentata per evitare l'inibizione della crescita cellulare causata dalla tossicità dei prodotti di scarto. Data la possibilità di racchiudere migliaia di fibre cave in un singolo bioreattore, la superficie disponibile nella cartuccia aumenta notevolmente e si hanno densità superiori a 10^8 cellule/mL.  

I bioreattori a fibra cava, rappresentano un esempio per generare colture ad alta densità, capaci di sostenere la crescita cellulare continua per molti mesi con un elevato potenziale di automazione (William G. Whitford John J.S. Cadwell 2011; Allan et al., 2019). Cellular Agriculture Ltd è un esempio di un'azienda che sta sviluppando un bioreattore a fibra cava adattato a questo tipo di cellule. Inoltre, nuove tecniche che utilizzano cellule costruite all'interno di tubi basati su alginato con un diametro di 400 micron offrono un enorme potenziale per la produzione di carne coltivata in ambienti microchiusi . 

Cinetica - Kinetics

E' importante regolare adeguatamente la fase di crescita cellulare per ottenere una biomassa sufficientemente elevata prima di entrare nella differenziazione cellulare (fase non proliferativa). In genere la crescita è modellata utilizzando l'equazione di Moser. 

Bibliografia - Bibliography

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• Stem Cells Culture Bioreactor Fluid Flow, Shear Stress and Microcarriers Dispersion Analysis Using Computational Fluid Dynamics: https://www.biotechrep.ir/article_69217_d41d8f11ebd299013d747fa36e9f3321.pdf  Hanna L. Tuomisto, Scott J. Allan, Marianne J. Ellis, Prospective life cycle assessment of a bioprocess design for cultured meat production in hollow fiber bioreactors,Science of The Total Environment,Volume 851, Part 1, 2022,158051,ISSN 0048-9697,https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2022.158051.  

• BodiouVincent, Moutsatsou Panagiota, Post Mark J.TITLE=Microcarriers for Upscaling Cultured Meat Production JOURNAL=Frontiers in Nutrition 2020, https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2020.00010 - DOI=10.3389/fnut.2020.00010  

• https://gfi.org/science/the-science-of-cultivated-meat/deep-dive-cultivated-meat-bioprocess-design/ 

• Advancing our understanding of bioreactors for industrial-sized cell culture: health care and cellular agriculture implications Chang Ge, P. Ravi Selvaganapathy, and Fei Geng 16 AUG 2023https://doi.org/10.1152/ajpcell.00408.2022 

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