GLI ANTIBIOTICI

Vediamo per prima cosa la definizione del termine «agente antimicrobico»: è qualsiasi sostanza di origine naturale, semisintetica o sintetica atta ad eliminare o ad inibire la crescita di un microrganismo senza causare danni, o causando danni limitati, all'organismo ospite.

È probabile che gli antibiotici fossero già usati secoli prima di essere scoperti dalla scienza moderna, infatti sono state rilevate tracce di tetraciclina (ottenuta dalla birra che conteneva Streptomyces) in mummie millenarie della civiltà Nubiana e successivamente si sa che anche gli Egizi la utilizzarono per trattare disturbi gengivali. I cinesi utilizzarono, invece, un impasto di orzo e di muffa di mele per curare le ferite dei soldati.

LA PENICILLINA

La penicillina è stato il primo antibiotico utilizzato in campo medico. Alexander Fleming nel 1929 scoprì e riuscì a dimostrare che era efficace nei confronti di vari batteri, però non riuscì a estrarre la sostanza battericida dalla muffa né a renderla utilizzabile come cura, processo che avvenne nel 1940. Si è dimostrata un farmaco molto efficace che provoca pochi effetti collaterali (a parte reazioni allergiche in alcune persone sensibili). Questo dipende dal fatto che la penicillina attacca un processo che esiste solo nei batteri, mentre è assente negli organismi superiori. Un altro vantaggio della penicillina è che attacca enzimi che si trovano fuori della membrana citoplasmatica dei batteri e quindi può agire direttamente su questi enzimi. 

Tuttavia l’italiano Vincenzo Tiberio un ricercatore e ufficiale medico della Marina Militare italiana scoprì il potere battericida di alcuni estratti di muffe nel 1895 (34 anni prima di Fleming), tuttavia nessuno capì l’importanza dei suoi studi, che erano molto avanzati per l’epoca, anche a causa che l’Italia al tempo non godeva di particolare rilevanza nel mondo scientifico e la rivista che pubblicò il suo articolo, non aveva il giusto rilievo.

Dal punto di vista chimico, la molecola risulta formata dall'unione di due amminoacidi, la cisteina e la valina, che formano un anello tiazolidinico unito a un anello β-lattamico. I gruppi funzionali principali sono: carbossile in posizione 3, 2 metili in posizione 2 e il gruppo amminico in posizione 6 acilato con acidi di tipo diverso, responsabili delle diverse caratteristiche delle penicilline.

E’ poco resistente all'azione degli agenti chimici e fisici, viene distrutta rapidamente dal calore, dai metalli pesanti, dagli acidi e dagli alcali. La penicillina è una polvere bianca, poco solubile in acqua, solubile nei solventi organici. I suoi sali di sodio e di potassio sono solubili in acqua, ma poco stabili.

MECCANISMO D’AZIONE 

Le penicilline hanno azione battericida per inibizione della sintesi, al terzo stadio del processo, della parete batterica. La struttura che conferisce alla parete rigidità e resistenza è il peptidoglicano, un polimero contenente aminozuccheri (acido N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico), la cui formazione e integrità dipende dai legami crociati dello scheletro glicolipidico (transpeptidazione) che avviene tramite transpeptidasi e carbossipeptidasi, enzimi posizionati dalla parte interna della parete, chiamati anche proteine leganti la penicillina (PBP) poiché contengono siti attivi in grado di legare gli antibiotici beta lattamici.

Dato che la penicillina è chimicamente simile ad una sequenza D-alanina-D-alanina, si lega agli enzimi che hanno il compito di sintetizzare il peptidoglicano (con un meccanismo competitivo) e li blocca perché l'anello lattamico si apre ma non si spezza e rimane legato al sito attivo inattivandolo formando un complesso acil-enzima molto stabile.

Alcuni ceppi batterici sono resistenti alle Penicilline perché sintetizzano enzimi (β-lattamasi) che neutralizzano le penicilline, contengono pompe di estrusione (nei Gram -) o sono impermeabili al farmaco (mancanza di porine, pori idrofili dei Gram- che il farmaco deve attraversare per raggiungere il bersaglio).

Le β-lattamasi sono capaci di rompere la struttura della penicillina e il meccanismo di idrolizzazione avviene in due fasi: acilazione e deacilazione.

DISPONIBILITA’

Il valore delle vendite mondiali di penicillina è di circa $15 miliardi all'anno.

Sebbene l’Europa sia il produttore principale degli antibiotici del beta-lattame, le più nuove installazioni industriali stanno nascendo in Asia, regioni in cui il lavoro ed i costi energetici sono più bassi, diventando così un nuovo punto di forte contrasto tra USA e Cina.

Infine a livello mondiale si nota una grande disegualianza di disponibilità di medicinali tra paesi ricchi e poveri, in netto contrasto con gli obbiettivi fissati dall’ONU per lo sviluppo sostenibile dell’agenda 2030.

PRODUZIONE PENICILLINA G

Analizziamo ora un esempio di produzione di antibiotici, studiandone i passi principali.

La penicillina è un metabolita secondario, la cui formazione non è collegata direttamente alla crescita del fungo. La penicillina inizialmente veniva prodotta utilizzando il microrganismo Penicillium notatum, ma oggi viene prodotta tramite il Penicillium chrysogenum, che permette una più alta produttività. Il processo fermentativo si articola nelle seguenti fasi:

• SPORIFICAZIONE: le spore si ottengono seminando i ceppi selezionati su terreni adatti, in provetta a 24°C. Nel terreno la fonte di carbonio è costituita da melasso, quella di azoto da estratto di carne.

• GERMINAZIONE: le spore vengono trasferite in palloni da 2 a 5L a 24°C per 24-48 ore. Il terreno è a base di acqua di macerazione del mais, addizionato con melasso e olio estratto da grasso animale.

• FASE VEGETATIVA/TERRENO: si preleva dal germinatoio lo 0,3% dell'inoculo rispetto al volume da ottenersi e lo si semina. Il terreno di coltura è costituito dalle acque di macerazione del mais, ricco di amminoacidi, sali minerali, vitamine e con un buon contenuto di zuccheri. Altri componenti sono olio o farina di soia e di pesce, lattosio, glucosio, amidi e acido fenilacetico, il precursore della catena laterale. Si addiziona inoltre un antischiuma, il solfato d’ammonio (come correttore di pH, pH=6,5) e aria sterilizzata e filtrata a 0,45 e poi 0,2 micrometri (portata 0,4- 0,8 mmol/min L). Temperatura = 23-28°C. La formazione della penicillina è inibita dalla presenza di glucosio (repressione da catabolita) e in pratica non ha luogo finché c’è un eccesso di fonti di carbonio. Quindi il dosaggio iniziale del glucosio è fatto in modo da assicurare la crescita voluta. Un tempo si utilizzava il lattosio, aggiunto fin dall’inizio, ma attualmente si preferiscono piccole aggiunte, perfettamente dosate, di glucosio. 

• FERMENTAZIONE: I batteri cominciano a duplicarsi in una fase iniziale di crescita esponenziale e poi si prosegue in quella stazionaria. Per la fase iniziale si deve favorire la crescita del fungo mentre per quella finale si cerca di massimizzare la produzione dello specifico antibiotico.  La muffa si sviluppa attraverso un metabolismo aerobico: glicolisi del glucosio che produce piruvato, trasformazione del piruvato in acetil coenzima A, ciclo di Krebs dove il piruvato è demolito in CO2 e infine c’è la fosforilazione ossidativa e la riossidazione dei coenzimi ridotti. La reazione complessiva è: C6H12O6 +6O2 +38ADP +38PI à 6CO2 +6H2O +38ATP

• FILTRAZIONE: La fermentazione in 5/7 giorni produce una quantità di penicillina pari a 0,12 g per grammo di carboidrato consumato. Alla fine della fase di fermentazione il brodo viene inizialmente filtrato, tramite filtro rotativo, per separare le cellule e gli alti prodotti insolubili.

• RAFFREDDAMENTO: In uno scambiatore di calore fino a 4°C per evitare la degradazione enzimatica della penicillina nella successiva fase di estrazione.

• ACIDIFICAZIONE E ESTRAZIONE: Quindi si aggiunge acido solforico sino a pH 2 per trasformare la penicillina nella sua forma acida, che consente l’estrazione con solventi organici come acetato di amile o di butile in un estrattore Podbielniak. Si lavora con un rapporto acetato di amile/brodo di fermentazione di 1:10 ottenendo una purezza del 75-80%.

• PURIFICAZIONE: L'estratto contenente la penicillina viene filtrata con un filtro a carboni attivi (il quale si basa sull'assorbimento in cui le molecole delle sostanze assorbite vengono trattenute sul carbonio da forze deboli, Van der Waals. Inoltre vi è una parziale deposizione delle particelle colloidali sulla superficie del carbonio), che ha il compito di rimuovere i pigmenti, impurezze, restituendo un liquido decolorato.

• PRECIPITAZIONE E CENTRIFUGAZIONE: La penicillina viene fatta precipitare con l’aggiunta di citrato di sodio o di potassio ed i cristalli, separati per centrifugazione, vengono fatti accrescere con una moderata agitazione e nuovamente centrifugati.

• ESSICAZIONE: I cristalli infine vengono lavati con solventi volatili, come alcol propilico o butilico, ed infine essiccati con aria calda, calore o per passaggio in camera sotto vuoto.

• SMALTIMENTO SOTTOPRODOTTI: Oltre ai reflui che vengono inviati ad un impianto di depurazione, la biomassa è il principale sottoprodotto della fermentazione e ha un buon contenuto di sostanze bioattive (proteine, vitamine, ormoni) che lo rendono un integratore per l’alimentazione animale, ma la presenza di penicillina ne rende impossibile l’utilizzo e difficile lo smaltimento.

Una volta i trattamenti prevedevano l’acidificazione seguita dall’essiccamento per decomporre la penicillina, però era un processo dispendioso energeticamente.

I trattamenti biologici (biorisanamento), più recenti, utilizzano ceppi di microrganismi resistenti all’antibiotico, come i lattobacilli (che hanno la capacità di sintetizzare la β-lattamasi, un enzima in grado di idrolizzare l’anello β-lattamico nella molecola della penicillina). Si opera in anaerobiosi e il processo prevede una fermentazione lattica per ottenere un prodotto privo di penicillina che può essere utilizzato come integratore o fertilizzante.

MISURAZIONE DELLA PENICILLINA NEL BRODO DI FERMENTAZIONE

Tramite le seguenti tipologie di analisi:

• HPLC: tecnica cromatografica diffusa, efficace e versatile e che non richiede la vaporizzazione del campione.

• ELETTRODO ENZIMATICO: Per la misura si utilizza un elettrodo enzimatico (solitamente costituito da una proteina recettore, un enzima o un anticorpo, che può essere basato sia sulla trasformazione catalitica di una sostanza, sia sulla rilevazione di enzimi inibitori o mediatori) sensibile alla penicillina. Il tempo di risposta dell'elettrodo è di 2min e la risposta alla concentrazione è lineare nell'intervallo da 1 a 10 mM. Inoltre la sensibilità dell'elettrodo alla penicillina è alta, ma sensibile alle piccole variazioni del pH.

• ENZYME THERMISTOR: Al termistore enzimatico è stata applicata la penicillinasi (enzima) per l'analisi calorimetrica. L'enzima viene applicato legato al vetro poroso o al nylon. L'intervallo di concentrazione lineare utile è compreso tra 0,1 e 100 mM. 

• SPETTROSCOPIA RAMAN: è una tecnica di analisi basata sul fenomeno di diffusione di una radiazione elettromagnetica monocromatica da parte del campione analizzato.

ANTIBIOTICI NEI PRODOTTI ALIMENTARI 

La penicillina ancora oggi è molto utilizzata sugli animali per esempio contro la mastite, un'infezione batterica della mammella della mucca da latte. Per la protezione dei consumatori e per la sicurezza dei processi nell'industria lattiero-casearia, nel regolamento (UE) n. 37/2010 della Commissione sono stati stabiliti limiti massimi di residui per 7 penicilline negli alimenti di origine animale. Per esempio il limite della benzilpenicillina è di 50 μg /, nel latte 4 μg /L e 0 μg /L per animali che producono uova destinate a consumo umano).

Caso studio: Screening di antibiotici e analisi chimica dei residui di penicillina nel latte fresco e nei prodotti lattiero-caseari tradizionali nello stato di Oyo, Nigeria

Screening dei residui di antibiotici nel latte: Per prima cosa si utilizza un kit commerciale per individuare residui di antibiotici (R-Biopharm AG, Germania). Il test si basa sull'inibizione della crescita di Bacillus stearothermophilus. I campioni positivi sono stati poi estratti e ripuliti per ottenere analiti.

Condizioni cromatografiche e calibrazione: Le analisi sono state eseguite presso il Laboratorio di analisi chimiche del Institute of Science Laboratory Technology della Nigeria, Ibadan utilizzando una macchina HPLC Agilent dotata di una pompa a flusso costante e un rivelatore a ultravioletti a lunghezza d'onda variabile fissato a 204nm e portata di 1,5 mL/min. L'eluizione della penicillina dall'analita è stata eseguita su una colonna nucleosil C-18 (10 μm, 250 mm × 4,0 mm 1D) con FM di acetonitrile 0,01M e 0,025M di KH2PO4 a pH 3,0. Il volume iniettato è stato di 20 μg.

La diluizione della soluzione madre std di penicillina G (1000 ppm) è stata effettuata per ottenere 0,4656, 0,1862 e 0,0931 ppm. Queste concentrazioni sono state iniettate nella macchina HPLC per ottenere la retta di calibrazione y = 36726x + 1122 con R 2 = 0,998. Il tempo di ritenzione era di 6,36-6,47 minuti e il LIR di 0,01 ppm.

Preparazione del campione: Si prendono 2 mL di campione e si aggiungono 2 mL di acetonitrile. Si centrifuga, si preleva il surnatante e si aggiungono 3 mL di acetonitrile, e si centrifuga per 5 minuti a 8000 rpm. La soluzione eluita è stata evaporata a secchezza e ricostituita in 1 mL di FM.

Analisi HPLC di campioni per penicillina: La FM è stata filtrata attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm usando una pompa per vuoto e regolarmente degassata per sonicazione. Anche la macchina HPLC è stata lavata con metanolo e la FM è stata lasciata passare attraverso la macchina per il condizionamento durante il quale è stata ottenuto una linea di base stabile. Le aree dei picchi medi dei campioni corrispondenti al tempo di ritenzione tra 5 e 6 minuti ottenuti dallo std di riferimento sono state registrate come positive per la penicillina. La quantificazione dei residui nei campioni è stata ottenuta dal calcolo sostituendo le aree di picco medie nell'equazione lineare ottenuta dalla curva di calibrazione dello standard.

Su quasi 600 campioni il 40% di essi era superiore a 10 μg /L, sul limite di legge 5 μg /L (in UE tale limite è di 4 μg /L).

ANTIBIOTICI NEI PRODOTTI COSMETICI

Durante gli anni '50 gli antibiotici sono stati aggiunti ad alcuni cosmetici, come dentifrici, creme per l'acne, shampoo antiforfora, deodoranti, per contrastare gli effetti noti o sospetti dell'azione batterica, ma anche conservare più a lungo il prodotto. Tuttavia il loro utilizzo può far sviluppare batteri resistenti agli antibiotici. Gran parte di questa attività si sono svolte negli USA in quanto la legislazione ha consentito il loro utilizzo (come per esempio il triclosan vietato solo nel 2017, mentre in UE gli antibiotici nei cosmetici sono stati vietati con la direttiva 76/768/CEE del Consiglio del 27 luglio 1976). Per di più recentemente un team di ricerca britannico ha dimostrato che i prodotti cosmetici mal conservati o scaduti, come rossetti, eyeleiner, mascara possono contenere batteri resistenti agli antibiotici come l’Escherichia coli e lo stafilococco aureo. Dei circa 500 prodotti analizzati, l’ 80% era contaminato da batteri.

Caso studio: Analisi degli antibiotici della penicillina nei cosmetici mediante cromatografia liquida ad altissime prestazioni

Un team cinese nel 2011 per rilevare le penicilline nei prodotti cosmetici ha sviluppato un metodo rapido e sensibile per l'analisi di 5 antibiotici di penicillina utilizzando una cromatografia liquida (UPLC) ad alte prestazioni con UV-PDA. I campioni sono stati preparati mediante estrazione liquido-liquido e quindi le analisi sono state eseguite su UPLC-PDA. Nel report la colonna cromatografica utilizzata era Acquity UPLC TM BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) e la FM era composta da Acetonitrile e potassio diidrogeno fosfato (PBS) soluzione tampone pH 5,5. La separazione cromatografica è stata ottenuta mediante eluizione a gradiente. Su 100 campioni analizzati solo due superavano i limiti di legge.

Un altro metodo rapido e innovativo sviluppato sempre in Cina è l’analisi attraverso l’utilizzo di una spettrometria di massa di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice, ottima per l'analisi di composti termolabili e ad alto peso molecolare.

CONTRAFFAZIONE  -  Morire a causa delle cure

Guardando inizialmente il quadro generale nel 2015, nell’Africa subsahariana, 122mila bambini sotto i 5 anni sono morti a causa di antimalarici di cattiva qualità; nel marzo 2019, in Camerun è stato ritrovato un principio attivo per il diabete in un farmaco per l’ipertensione che aveva provocato crisi ipoglicemiche in diversi pazienti; nel giugno 2012, in Angola era stato sequestrato un container proveniente dalla Cina che trasportava 1,4 milioni di barattoli di false compresse antimalaria che non contenevano alcun principio attivo ed erano composte di fosfato di calcio, acidi grassi e colorante giallo. In Niger, poi, fra il 2017 e il 2019, si sono avute diverse epidemie di meningite che hanno provocato 358 morti. Il commercio Illegale è presente in 128 Paesi e a livello mondiale vale 200 miliardi di dollari e la cosa più grave è che i prodotti illegali non sono più acquistabili solo nei mercati o in strada, ma anche in supermercati e farmacie 

Tornando agli antibiotici l'OMS nel 2017 ha lanciato una allerta riguardante la falsificazione di Penicillina-V. Le indagini hanno evidenziato nel farmaco l'assenza di penicillina-V e la presenza del più economico paracetamolo. Esso si trovava in quantità sufficiente a indurre un effetto antipiretico, così da far ritenere al medico e al paziente che il farmaco stesse facendo effetto, comportando un ritardo nell'inizio di una terapia efficace e successivamente la convinzione che l'infezione sia causata da un batterio resistente alla penicillina.

ALLERGIE ALLA PENICILLINA

L'OMS evidenzia i pericoli della somministrazione della penicillina a soggetti allergici e indica come suo sostituto la cefazolina. Se a seguito dell’assunzione il soggetto manifesta sintomi come nausea, difficoltà respiratorie, pressione bassa, giramenti si raccomanda la somministrazione immediata di antistaminici, per evitare il sorgere di problemi più gravi o la morte.

ANTIBIOTICI: Batteri e virus

Ricapitolando il batterio è un microrganismo vivente con una serie di apparati ed enzimi che gli consentono di avere un proprio metabolismo. L’antibiotico agisce bloccando alcune funzioni vitali del batterio, uccidendolo (batterici) o impedendone la moltiplicazione (batteriostatici).

​Il virus invece non è una cellula, ma una particella molto più piccola, formata da DNA o RNA e proteine, che non può sopravvivere da sola a lungo nell’ambiente e per vivere e moltiplicarsi deve invadere un altro organismo. L’antibiotico quindi non riesce a contrastarlo. Il virus usa vie metaboliche vitali all’interno delle cellule ospiti per replicarsi, è quindi difficile eliminarlo senza usare farmaci che siano tossici alle cellule dell’ospite. Per questo da oltre un secolo l’approccio migliore per le malattie virali sono le vaccinazioni.

RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI

I batteri sono caratterizzati da diversità genetica e flessibilità, perciò nel corso della suddivisione e della moltiplicazione possono subire alterazioni casuali, mutazioni, della configurazione genetica in grado di innescare una resistenza agli antibiotici. Dato che i batteri si riproducono con grande velocità, con decine di generazioni ogni giorno, la loro evoluzione è sorprendentemente rapida. 

Dalla scoperta della penicillina gli antimicrobici hanno rivoluzionato la società, malattie che erano una volta letali ora richiedono poco più di una breve cura. Questi risultati sono a rischio, soprattutto a causa dell'uso eccessivo o improprio di antibiotici, che è all'origine della comparsa e della diffusione di batteri multi resistenti.

Secondo le attuali tendenze potremmo trovarci di nuovo nelle condizioni dell'epoca precedente agli antibiotici, dove una ferita potrebbe avere effetti letali, e normali procedure mediche potrebbero diventare rischiose. Un rapporto dell’UE evidenzia come il fenomeno sia in progressivo aumento e consiglia forti investimenti nella ricerca nello sviluppo di nuove terapie. Attualmente, almeno 700.000 persone muoiono ogni anno a causa di malattie dovute ai batteri resistenti ai farmaci e in aggiunta l’ONU ha stimato che a partire dal 2050 si rischiano più di 10 milioni di morti nel mondo all’anno con una previsione di costi che supera i 100 trilioni di dollari. Quindi entro il 2050 i batteri resistenti agli antibiotici uccideranno una persona ogni 3 secondi diventando così la prima causa di morte. 

Lo stesso Fleming al conferimento del Nobel dichiarò:

"Chiunque giochi con la penicillina senza pensare alle conseguenze, è moralmente responsabile del decesso di chi morirà per una infezione sostenuta da un microrganismo resistente alla penicillina”.

FONTI

• http://www.salute.gov.it/

• https://www.aifa.gov.it

• http://www.sapere.it/

• http://www.fvcalabria.unicz.it/

• https://www.news-medical.net/health/

• https://www.corriere.it/

• https://www.pianetachimica.it

• http://www.paginesanitarie.com/principi_attivi/penicillinag/

• Storia della farmacologia Roberto Leone, Ugo Moretti Dipartimento di Diagnostica e Sanità Pubblica Sezione di Farmacologia

• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5057032/ Osotimehin K. O, Tijani A. A, Olukomogbon E. O. An economic analysis of small scale dairy milk processing in Kogi State, Nigeria e Iro I. The Fulani Milk Maid and Problems of Dairying in Nigeria.

• Ricerca avanzata sui materiali a cura di Zhong Cao, Lixian Sun, Xueqiang Cao, Yinghe He

• https://worldmapper.org/maps

• An enzyme electrode for measurement of penicillin in fermentation broth: a step toward the application of enzyme electrodes in fermentation control di Hans Nilsson ,Klaus Mosbach ,Sven‐Olof Enfors ,Nils Molin

• Enzyme thermistor analysis of penicillin in standard solutions and in fermentation broth di Mattiasson , Bengt Danielsson , Fredrik Winquist , Hans Nilsson , Klaus Mosbach

• Rapid Monitoring of Antibiotics in fermentation broths using Raman and Surface Enhanced Raman Spectroscopy di Sarah J Clarke, Rachael E Littleford, W Ewen Smith, Royston Goodacre

• https://www.ilfattoquotidiano.it/2020/02/02/farmaci-contraffatti-business-che-uccide-lafrica-e-finanzia-i-terroristi-migliaia-di-bimbi-morti-a-causa-di-antimalarici-scadenti/5680689/

• http://www.cosmeticsandskin.org/

• Direttiva 76/768/CEE del Consiglio, del 27 luglio 1976, concernente il ravvicinamento delle legislazioni degli Stati Membri relative ai prodotti cosmetici

• Microbiological Study of Used Cosmetic Products: Highlighting Possible Impact on Consumer Health

• U.S. Food & drug administration

• Gazzetta ufficiale n. C 407 del 28/12/1998 pag. 0007 UE -  Parere del Comitato economico e sociale sul tema «La resistenza agli antibiotici: una minaccia per la salute pubblica»

• Tecnologie chimiche industriali volume terzo Edisco di S. Natoli e M. Calatozzo

• Kelley, J.A., Kuzin, A.P., Charlier, P. and Fonze, E. (1998) X-ray studies of enzymes that interact with penicillins. Cell and Molecular Life Sciences 54

• Waxman, D.J. and Strominger, J.L. (1983) Penicillin-binding proteins and the mechanism of action of beta-lactam antibiotics.