1)ITC - ISOTHERMAL TITRATION CALORIMETRY

L'ITC, o calorimetria a titolazione isotermica, rappresenta un potente strumento per la misura diretta del calore generato durante l'interazione tra due molecole in soluzione. Questo metodo presenta diversi vantaggi e limitazioni che è importante considerare.

Vantaggi:

1. Misura diretta dell'interazione: fornisce una misura diretta del calore scaturito dall'interazione tra le molecole senza la necessità di utilizzare additivi o modificare le molecole coinvolte.

2. Utilizzo delle molecole nella forma nativa: Le molecole possono essere utilizzate nella loro forma nativa, evitando la necessità di modificarle. Ad esempio, la sostanza solida può essere silobulizzata per mantenere la sua integrità.

3. Ampia applicabilità alle soluzioni chimiche: Comunque un ampio range, sia per sostanze solubili in acqua sia idrofobici, tramite solventi apolari.

4. Risposta a differenze dimensionali: L'ITC può essere preferibile in situazioni in cui le dimensioni del sistema sono troppo distanti per altre tecniche, come la risonanza nucleare magnetica.

5. In un unico esperimento fornisce dH,Ds, kp. ΔG = ΔH - TΔS, determina dG, costante dissociazione, dCp. Anche n, stechiometria che indica quante molecole di a interagiscano con quante di b.

6. Facile da utilizzare, più elaborato è gestire i dati. 

Svantaggi:

1. Diluizione delle soluzioni: Quando le soluzioni si mescolano, avviene una diluizione reciproca, e il calore sviluppato può essere influenzato da questo processo. 

2. Limiti di sensibilità: Il limite della generazione di calore può rappresentare una sfida, specialmente quando si lavora con reazioni che producono quantità di calore molto piccole. Inoltre, la temicità della reazione può costituire un altro limite.

3. Complessità di interpretazione: La visualizzazione completa del processo può essere sia un punto di forza che una debolezza. La comprensione e l'interpretazione dei dati richiedono un'analisi approfondita per distinguere gli effetti desiderati da quelli indesiderati.

a) PRINCIPI CHIMICI

Calorimetrico: generiamo un flusso di calore che andrà fatto passare in due celle. Una un sistema chiuso, per un riferimento, e uno del campione. Si crea un flusso di calore, le due celle vanno in equilibrio termico.Il flusso di calore a 25°C temperatura standard serve per avere una T di riferimento.

La siringa di titolazione contiene la soluzione del ligando, mentre la cella campione contiene la soluzione proteica e la cella di riferimento ospita acqua o una soluzione tampone. 

Il funzionamento si basa sulla misurazione del flusso di calore in termini di mcal o mJ/s e sul calcolo della potenza differenziale (DP). 

Durante l'esperimento, è essenziale che la cella campione e la cella di riferimento raggiungano l'equilibrio termico (ΔT° = 0). La potenza di riferimento viene quindi applicata ad entrambe le celle, garantendo la compensazione di potenza. L'osservazione di rilasci o assorbimenti di calore durante l'esperimento indica rispettivamente reazioni esotermiche o endotermiche.

Durante il processo di titolazione, è fondamentale osservare il ripristino del flusso di calore al valore di base. Verso la fine della titolazione, il segnale di calore spesso diminuisce significativamente. Questa riduzione del segnale di calore può essere attribuita alla saturazione da parte del titrante. In questo momento, si osserva solo il calore di fondo, derivante da fenomeni non specifici come la diluizione del ligando o l'attrito del liquido. Il segnale di calore che diminuisce e il ritorno al valore di base indicano che il sistema ha raggiunto un punto in cui il titrante non partecipa più attivamente a interazioni specifiche e ogni calore residuo è principalmente associato a effetti non specifici o di fondo. Questa fase della titolazione è essenziale per un'interpretazione accurata dei dati e consente ai ricercatori di distinguere gli eventi di legame specifici da altri fattori che contribuiscono alle misurazioni calorimetriche.

--> In genere la cella di riferimento e la cella campione vengono impostate alla temperatura sperimentale desiderata. Il ligando viene caricato in una siringa posizionata in un dispositivo di iniezione molto preciso. Il dispositivo di iniezione viene inserito nella cella campione contenente la proteina di interesse. Una serie di piccole aliquote di ligando vengono iniettate nella soluzione proteica. Se il ligando si lega alla proteina, vengono rilevate e misurate variazioni di calore di pochi milionesimi di grado Celsius. Quando viene effettuata la prima iniezione, il microcalorimetro misura tutto il calore rilasciato finché la reazione di legame non ha raggiunto l'equilibrio. La quantità di calore misurata è direttamente proporzionale alla quantità di legante.

Su asse delle x il tempo in minuti, su quello delle y il calore microcal/s. For a process A --> X ( under constant pressure) the total heat (Q) exchanged is:

Q = -∆H∗X

• DH is the enthalpy of the process

• X the quantity of the product/complex formed.

• The heat flux (DP = dQ/dt) is calculated as:

dQ/dt = DP = -∆H ∗ dX/dt 

Bisogna individuare dove inizia e finisce il picco (quando torna alla linea di base). Dai dati grezzi si calcola l'integrale e la si normalizza per la quantità (da microcal/s a microcal e poi convertite in cal/mol). Il punto di flesso ricavato è uno dei punti più importanti, perché direttamente otteniamo l'informazione sull'asse delle x.

La presenza di un campione nella cella guida l'interazione e deve essere sopra \( K_d \). La maggior parte del ligando iniettato si lega nelle prime iniezioni per raggiungere una plateau inferiore (\( \Delta H \)). È essenziale avere un numero sufficiente di punti dati durante la transizione per definire la curva di legame, evitando concentrazioni troppo elevate. Inoltre, è importante avere abbastanza ligando per saturare tutti i siti di legame. 

Ad esempio, se il rapporto è 1:1, è consigliabile utilizzare una concentrazione di ligando dieci volte superiore a quella della cella. Questi accorgimenti sono cruciali per ottenere dati accurati e significativi durante un esperimento di calorimetria a titolazione isoterma, garantendo che l'interazione tra il ligando e la macromolecola sia adeguatamente rappresentata dalla curva di legame ottenuta.

Bisogna avere un numero sufficiente di punti per descrivere il sistema. La siringa ha un volume massimo.

Risultati diretti :

• Kd and n (stoichiometry) = inflection point 

• DHbind = differences between lower and upper plateaus

Risultati indiretti:

• DGbind = RTlnKd

• TDSbind = DGbind - DHbind

Possiamo avere sistemi come polimeri idrofili, proteine, se messi in un sistema acquoso, fa si che si instaurino sulla superficie uno Shell di solvatazione, molecole d'acqua e scambio protonici che circondano la superficie e stanno li a circondare le molecole. Per molecole piccole, il rilascio di molecole d'acqua e ioni sarà minimo e non influenzerà molto il sistema, come nel classico interazione molecola farmaco. Ma quando abbiamo due grosse macromolecole le superfici dopo sono quelle più ampie, possono muoversi più liberamente e qui quindi questo rilascio favorisce la reazione di legame, le piccole molecole vanno in un ambiente più favorevole per loro. Spesso questo è poco intuibile se andiamo ad analizzare semplicemente le due molecole. Questo può essere analizzato, si valuta la formazione del complesso.

Per esempio avendo tre molecole, possiamo avere i dati di dG, dH e -TdS. Ricordando che dG negativo indica una reazione spontanea. Dall'immagine si deduce che:

A) Buone interazioni idrogeno con un cambio di configurazione sfavorevole

B) Domina il carattere idrofobico

C) Favorevole hai legami idrogeno e alle interazioni idrofobiche

-->Termodinamica di Binding

Temperatura ITC = impostata nell'intervallo da 2 a 85°C

Numero di iniezioni: è un parametro di compromesso

• 12 (3 mL ciascuna) si ottengono 12 punti, 4 bassi, 4 in zona di flesso, 4 in zona alta, meglio di più, oppure 18 (2 mL ciascuna) / 36 (1 mL) / 72 (0,5 mL)

• Più volume porta a un maggiore calore di interazione. E più iniezioni portano ad un miglior adattamento.

Spaziatura delle iniezioni: il tempo tra ogni iniezione

• 60 – 600 s: per permettere al segnale di tornare alla linea di base

• Obbligatorio per un'ottimale integrazione del calore del picco. 

Calore di fondo dovuto a fenomeni non specifici - ESPERIENZE:

1. Titolazione acqua-in-acqua: calore dall'agitazione che rimane costante. Usando acqua distillata.

2. Titolazione tampone-in-tampone: calore dalla dissociazione protonica, sale stabilizza il pH.

3. Solubilizzazione del titolante: calore dalla solubilizzazione del titrante nel solvente. Passa da una soluzione molto concentrata in siringa per diluirsi nella cella fino a 100 volte

• Titolante nella siringa (alla stessa [M] della ITC "normale")

• Solo tampone nella cella di campione

• Sottrazione punto per punto

La forza dell'ITC è che puoi vedere tutto. Il limite dell'ITC è che puoi vedere tutto. La maggior parte dei problemi viene risolta pulendo accuratamente cella e siringa, pulire il modulo (automatico, tappo grigio scarti, blu acqua, bianco solvente e rosso alcoli). Lavare cella e siringa dopo ogni esperimento ITC (10 minuti). Ammollo a 65°C della cella di campione settimanalmente! Mismatch del tampone. Si suddividono in tre pulizie, una breve di 5 minuti per condizioni simili, una media di 12 minuti per pulizia e asciugata e con determinati solventi e infine una lunga di due ore ogni mese a 65°C. 

Possono essere utilizzati diversi tipi di tamponi (PBS, HEPES, ecc.), poiché l'ITC è compatibile con tutti i tamponi acquosi in un intervallo di pH 2–12. I tamponi nella cella di campione e nella siringa di titolazione DEVONO essere identici; in caso contrario, il calore totale misurato potrebbe tenere conto di contributi indesiderati dovuti a miscelazione e diluizione del tampone.

Importante avere lo stesso solvente alla stessa concentrazione.

https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=12258

b) CASO STUDIO- NANOMEDICINE

La nanomedicina a livello nanometrico sta rivoluzionando il campo della terapia genica attraverso lo sviluppo di complessi supramolecolari con proprietà modulabili. Questi nanocarrier funzionalizzati sulla superficie con gruppi positivi, come ammine protonate, dimostrano un'elevata efficienza legando molecole biologiche polianioniche come DNA, RNA, proteine ed eparina. Il principio fondamentale di interazioni elettrostatiche guida la progettazione di nanocarrier in grado di proteggere e consegnare agenti attivi al loro bersaglio biologico, mentre loro sono inattivi a livello biologico.

Per quanto riguarda il contesto terapeutico, siRNA, molecole di RNA interferente breve, giocano un ruolo chiave nel silenziare geni specifici, prevenendo la produzione di proteine indesiderate. Tuttavia, la limitata capacità di viaggiare nel sistema vascolare e attraversare le membrane cellulari richiede l'utilizzo di sistemi nanocarrier. La sfida consiste nella creazione di nanocarrier che, oltre a garantire l'efficiente legame del siRNA, offrano una protezione contro la degradazione, il trasporto mirato alla cellula bersaglio e agevolino la decomposizione del complesso siRNA/nanocarrier. 

In genere per i medicinali tra la loro scoperta e la commercializzazione passano una 20 d'anni, ma per i carrier non sono ancora definite degli iter specifici.

covalent cationic dendrimers (CCD) I dendrimeri cationici covalenti (dal greco albero) rappresentano una classe di macromolecole monodisperse caratterizzate da una struttura precisamente definita e una distintiva forma tridimensionale ramificata. Questi dendrimeri vengono costruiti attraverso legami covalenti, garantendo un elevato grado di uniformità nella loro composizione. La sintesi controllata dei CCD consente la creazione di strutture dendritiche con dimensioni e forme ben definite, conferendo loro vantaggi in diverse applicazioni. Questa natura cationica li rende particolarmente utili nei campi biomedico e nanomedico, dove la loro struttura controllata e la superficie carica facilitano le interazioni con entità biologiche cariche negativamente, come acidi nucleici o membrane cellulari.Tuttavia abbandonati dal 2010 perchè difficili da sintetizzare, troppe fasi e ad ogni volta più difficoltosa la sintesi. L'incremento di cariche + è esponenziale e in genere si arriva fino all'8^ generazione.

Amphiphilic cationic dendrons (ACD) Questi dendroni, strutture ramificate con proprietà anfifiliche che presentano sia gruppi idrofobi che teste idrofile. Sono monomeri che poi autonomamente vanno a formare il complesso non più con legami covalenti, ma con legami secondari.

Inoltre, l'approccio di progettazione si estende allo sviluppo di nanocarrier capaci di legare efficacemente l'eparina, sfruttando interazioni specifiche che superano in efficacia e riducono la tossicità rispetto alle attuali alternative come la protamina.

Self-Assembly 

L'auto-assemblaggio è la capacità di alcune nanostrutture complesse di comporsi spontaneamente in blocchi grazie alla formazione di interazioni complementari non covalenti, come forze elettrostatiche, legami ad idrogeno, interazioni di van der Waals ed effetti solvofobici. Le molecole anfifiliche in soluzione acquosa possono spontaneamente formare vescicole o micelle se la concentrazione supera la Concentrazione Micellare Critica (CMC).

• In terapia genetica usati i SiRNA (short interfering RNA) per silenziare la produzione di cellule carcerogene per esempio. Ma se liberi risultano essere poco stabili, per questo servono sistemi di vettori che si auto assemblano e che arrivate al bersaglio si scindono liberando il farmaco. Si può anche studiare la rottura a seconda del pH. 

• Inoltre, per un vaccino è indifferente dove si vada a finire, basta che il sistema immunitario lo riconosca. Per una terapia tumorale invece no, essa è locale.

PRO:

• Stato ordinato più elevato

• Legami deboli (non covalenti)

• Sistemi più flessibili nel design

• Monitoraggio conveniente del processo di produzione

• Modo unico per creare prodotti specifici (ad esempio, componenti nanoscala)

Termodinamica completa del processo:

• dG → spontaneità

• dH → meccanismo

• TdS → contributo entropico

• CMC: Concentrazione Micellare Critica

• Nagg: Numero di Aggregazione, stechiometria

Siringa: Liposomi solidi di acido mefenamico a concentrazione >> CMC. quindi in forma di micelle

Cella di campionamento: solvente → H2O o buffer

Studio del processo di demicellizzazione → DHdemic.

L'auto-assemblaggio è un processo reversibile → DHdemic = -DHmic

Il termogramma ITC di un processo di demicellizzazione è caratterizzato da 3 fasi distinte:

1. Le micelle si dissociano in monomeri → viene registrato il calore della diluizione del monomero.

2. [AM] aumenta nella cella del campione fino a raggiungere il valore di CMC → formazione di micelle.

3. una volta completato il processo di auto-assemblaggio → solo il calore di diluizione micellare.

Grafico formato da una serie di picchi che via via vanno ad appiattirsi, poi si calcola l'integrale per trovare il punto di flesso.Ottengo tanti punti quante iniezioni.

Dal profilo sigmoideo posso estrarre diverse informazioni:

• Punto di flesso: Indica la Concentrazione Micellare Critica (CMC), ovvero la concentrazione al di sopra della quale le micelle iniziano a formarsi.

• Prima derivata di Q rispetto a C: Analizzando la derivata prima della relazione tra la quantità di micelle (Q) e la concentrazione (C), è possibile ottenere una CMC più precisa.

• Differenza tra i plateau: La differenza tra i plateau della curva rappresenta la variazione di entalpia (-DHmic) associata alla formazione delle micelle quello in alto, mentre quello in basso l'entalpia di diluizione del monomero.

Validazione CMC

Per gli esperimento al TCI serve avere già un'idea del punto CMC, quindi si usano due metodi:

• Fluorimetro con pirene fluorescente nell'UV in acqua, formandosi le micelle rimuovono la sostanza dall'acqua e riducono l'emissione

• Conduttometro, quando si dissocia il campione si formano più monomeri e la conducibilità aumenta.

c) APPLICAZIONI

Si va quindi  a spiegare come due molecole interagiscono, analizzando anche la cinetica oltre che la termodinamica. Vediamo quindi una serie di applicazioni:

• Primo esempio è la comprensione dei legami tra farmaci e albumina sierica umana (HSA). Tali legami influenzano notevolmente l'attività biologica dei farmaci e un esempio concreto è rappresentato dallo studio del meccanismo di legame dei due inibitori di B-Raf, dabrafenib e vemurafenib, a HSA. Infatti si sa come i farmaci funzionano, ma si vuole comprendere meglio come si comportano in una soluzione acquosa ricca di proteine come è realmente nel corpo umano. L'approccio combinato di spettroscopia di fluorescenza, calorimetria isoterma di titolazione (ITC) e modellazione molecolare consente di ottenere informazioni dettagliate sulla termodinamica e la cinematica del processo. Le informazioni rilevate includono una stechiometria 1:1 e affinità comparabile all'interno dello stesso sito di legame (subdominio IIIA). Il complesso dabrafenib/HSA è guidato prevalentemente da un contributo entropico, mentre l'assemblaggio vemurafenib/HSA è prevalentemente entalpico. Inoltre, si evidenzia che il complesso dabrafenib/HSA ha una breve durata di residenza, mentre il complesso vemurafenib/HSA presenta una durata di residenza leggermente maggiore.

• Analogamente si può studiare il complesso chetobrufene - alabumina, ricavando i dati di cinetica di legame, cioè il tempo in cui il farmaco rimane legato alla proteina (Tramite il software KinITC)

• In un contesto diverso, un sistema nano basato su PAMAM (poliamidoamina) con coda singola C18 è stato progettato per fornire in modo efficiente agenti di contrasto o di imaging DIAGNOSTICO. Decorando la superficie di questi dendrimeri con diversi radionuclidi come Ga3+, Gd3+ o In3+ (isotopi radioattivi in concentrazioni non tossiche, ma nemmeno trascurabili, complessati in diversi chelatori macrociclici come NOTA o DOTA, si mira a migliorare la sensibilità, l'omogenea diffusione e la specificità dell'imaging, riducendo quindi la tossicità. Quindi si ha un ottimale posizionamento delle celle all'esterno della sfera consentendo una buona distribuzione, con buon rilascio e carico. Essendo farmaci già approvati è importante lavorare sulla loro diffusione nell'organismo piuttosto che iniziare una nuova ricerca che durerebbe 20 anni almeno. 

Questo sistema presenta un'applicazione promettente in tecniche di imaging avanzate come la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la tomografia computerizzata a emissione di fotone singolo (SPECT). Per i test in laboratorio vengono usati isotopi non radioattivi, essendo ininfluenti sul legame, e si fanno delle verifiche dei dati dell'ITC con le simulazioni molecolari dinamiche, lo scattering e la microscopia elettronica di trasmissione TEM.

• E' una tecnica sperimentale potente per caratterizzare il legame tra un radioisotopo come l'indio-111 e il suo chelante, che può essere DOTA (In-1) o NOTA (In-2). Nella calorimetria ITC, la variazione di calore viene misurata durante l'iniezione graduale del chelante nella soluzione contenente il radioisotopo. Questo permette di ottenere informazioni dettagliate sulla termodinamica del legame, inclusi entalpia (ΔH), entropia (ΔS), e costante di equilibrio (K).

Durante l'analisi ITC, è possibile determinare la costante di legame (K), che rappresenta l'affinità tra il radioisotopo e il chelante. Valori più elevati di K indicano una maggiore affinità e stabilità del complesso formato. Inoltre, la variazione di entalpia (ΔH) fornisce informazioni sulla natura esotermica o endotermica del legame. Una variazione negativa di entalpia indica un legame esotermico, mentre una variazione positiva indica un legame endotermico. L'entropia (ΔS) fornisce informazioni sulla variazione nell'organizzazione molecolare durante la formazione del complesso. Un ΔS positivo indica un aumento di disordine, mentre un ΔS negativo indica una maggiore organizzazione.

• BIOMOLECULAR INTERACTIONS AND MACROMOLECULAR ASSEMBLY sono utilizzate per dedurre il meccanismo di legame e le riarrangiamenti strutturali durante le interazioni/assemblee biomolecolari. Questo approccio viene impiegato in diverse aree di studio, tra cui:

  1. 1. Interazioni Proteina/Proteina: Per comprendere come le proteine interagiscono tra loro e formano complessi proteici

     2. Interazioni Proteina/Farmaco o Sostanze Chimiche: Utilizzato per studi tossicologici

     3. Interazioni Proteina/Nanoparticelle: Per investigare l'interazione delle proteine con nanoparticelle, includendo anche studi tossicologici

     4. Interazioni Proteina/DNA o RNA: Per comprendere come le proteine interagiscono con acidi nucleici e regolano i processi biologici correlati

     5. Interazioni Proteina/Membrana: Per studiare come le proteine interagiscono con le membrane cellulari e svolgono funzioni specifiche

     6. Interazioni Farmaco o Sostanze Chimiche/Membrana: Per valutare gli effetti tossicologici

     7. Interazioni Nanoparticelle/Membrana: Per valutare gli effetti tossicologici

• BIOCATALIZZATORI sono enzimi che, come il loro nome suggerisce, partecipano a reazioni catalitiche insieme ad un secondo co-catalizzatore. La calorimetria a titolazione isoterma (ITC) è una tecnica utile per misurare i parametri termodinamici e cinetici degli enzimi in modo diretto. Inibizione reversibile e irreversibile dell'enzima, l'attività degli enzimi inibiti per valutare se l'inibizione dell'enzima è completa o parziale e di studiare come l'attività dell'enzima viene influenzata dalla presenza di inibitori. Conversione di substrati polimerici complessi: L'ITC può essere utilizzato per studiare la cinetica e la termodinamica della conversione di substrati polimerici da parte degli enzimi, fornendo informazioni sulla specificità e sull'efficienza dell'enzima nella degradazione di substrati complessi. Utilizzando ITC, è possibile misurare:

  • • ΔH di reazione (entalpia di reazione): Questo parametro fornisce informazioni sulla variazione di calore associata alla reazione catalizzata dall'enzima. 

    • KM (costante di Michaelis-Menten): La KM rappresenta la concentrazione di substrato a metà velocità massima (Vmax/2).

    • Kcat (costante catalitica): La Kcat, o k2, rappresenta il numero di molecole di substrato convertite in prodotto da un singolo sito attivo dell'enzima al secondo quando l'enzima è satura di substrato. Vmax è uguale a Kcat moltiplicato per la concentrazione dell'enzima ([E]).

• STABILITY AND COMPATIBILITY STUDIES per ora a livello di laboratorio, e comprendono:

  1. 1. Studi sulla stabilità chimica: valutazione della degradazione chimica dei materiali o delle molecole (velocità di reazione di degradazione (DP), che è proporzionale al tasso di degradazione della sostanza).

     2. Studi sulla stabilità fisica: in relazione alla loro temperatura di transizione vetrosa (Tg). Le misurazioni del tempo di rilassamento o dell'entalpia (ΔH) al di sotto della Tg consentono una migliore previsione della stabilità.

     3. Attività microbiologica di monitoraggio: monitoraggio della crescita di microorganismi o cellule. L'attività metabolica delle cellule genera calore, che può essere misurato per valutare il rendimento e il tasso di crescita. Inoltre, è possibile determinare vari parametri come il consumo di substrato e ossigeno, e la produzione di CO2, al fine di comprendere meglio la cinetica di crescita dei microorganismi. Per esempio si mettono nella cella le cellule e in siringa si aggiunge glucosio, che è lo zucchero più semplice. Si nota anche come le cellule tumorali crescano in modo molto più rilevante essendo prive del meccanismo di controllo della crescita.

• INTERAZIONI NEI SISTEMI POLIMERICI

Questi spesso coinvolgono l'uso di solventi organici, che sono essenziali per la manipolazione dei polimeri e per favorire le interazioni con altre molecole o materiali. I solventi organici consentono la dissoluzione dei polimeri e possono influenzare le interazioni polimero-biomolecola, polimero-nanoparticella e le aggregazioni di polimeri.

• • 1. Interazioni Polimero/Biomolecole: lo studio delle interazioni tra polimeri e biomolecole, come proteine, acidi nucleici o carboidrati.

    2. Interazioni Polimero/Nanoparticelle: lo studio delle interazioni tra polimeri e nanoparticelle, che possono influenzare proprietà come la stabilità, la dispersione e le prestazioni funzionali dei nanomateriali polimerici.

    3. Aggregazioni Polimero o Co-polimero: lo studio delle aggregazioni o dell'auto-assemblaggio di polimeri o copolimeri, che possono influenzare la struttura, la morfologia e le proprietà dei materiali polimerici.

d) PREPARAZIONE STRUMENTAZIONE

1. Binding Experiment – Ca2+/EDTA Complex

In questo esperimento, viene studiata la formazione del complesso Ca2+/EDTA, dove EDTA agisce come agente chelante legandosi agli ioni metallici e formando complessi stabili. Viene usato per settare lo strumento.

EDTA è comunemente utilizzato in varie applicazioni industriali e biologiche; Nell'industria alimentare per preservare il colore e il sapore dei cibi, nel trattamento dell'acqua come agente chelante per prevenire la corrosione, nella ricerca biomedica e nelle diagnostica clinica per chelare gli ioni metallici e nelle formulazioni farmaceutiche per migliorare la stabilità e la biodisponibilità dei farmaci.

Condizioni dell'esperimento:

• Conc siringa mM CaCl2

• Conc cella 100 microM EDTA

• Commento esperimento con descrizione prova

• Temperatura: 25.0 °C

• Potenza di riferimento: 10.0 mcal/s. La potenza di riferimento è regolata tra 10 μcal/s (fenomeni esotermici) e 1 μcal/s (fenomeni endotermici), questo per garantire una migliore qualità del segnale, perché una reazione esotermica porta ad un abbassamento della potenza fornita e se sei parte bassi si rischia di arrivare a zero.

• Feedback: "High". Il feedback regola il tempo di risposta dello strumento. Un feedback più alto significa un tempo di risposta più breve, ma anche un rumore maggiore.

• Velocità di agitazione: 750 rpm  critico solo nel caso di membrane cellulari e sistemi delicati

• Ritardo iniziale: 120 s. Questo ritardo permette di stabilire una linea di base e valutarne la stabilità prima della prima iniezione. Comunque lo strumento ha una fase di assestamento iniziale a prescindere da questo valore.

• Iniezioni: 13

• Prima iniezione: 0.4 mL; 0.8 s; 120 s. La prima iniezione deve avere un volume inferiore rispetto alle altre (nel nostro caso, 0.4 μL) e il picco corrispondente sarà scartato perché il calore osservato da questa prima iniezione è inaccurato e sistematicamente più basso del previsto. Inoltre il primo volume non è omogeneo in genere. Anche se iniezioni con volumi diversi con integrazione si normalizza calore generato/assorbito sulla concentrazione inserita

• Altre iniezioni: 3.0 mL; 6.0 s; 120 s.

2. Micellization Experiment - Studio dell'auto-assemblaggio del CTAB

In questo esperimento, viene studiata l'auto-assemblaggio del cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), un surfattante cationico, attraverso la formazione di micelle.

Il CTAB è utilizzato in varie applicazioni chimiche e biologiche, tra cui estrazione e purificazione del DNA, formazione di micelle, sintesi di nanoparticelle, agente stabilizzante nelle formulazioni farmaceutiche e prodotti per la pulizia domestica

Condizioni dell'esperimento:

• In siringa 20mM di CTAB

• In cella 0M, solo acqua, questo non ci permette di avere un fitting, dovemo integrare noi la curva e trovare i dati richiesti.

• Temperatura: 25.0 °C

• Potenza di riferimento: 1.0 mcal/s

• Feedback: "High"

• Velocità di agitazione: 500 rpm

• Ritardo iniziale: 120 s. Questo permette di stabilire una linea di base e valutarne la stabilità prima della prima iniezione.

• Iniezioni: 19

• Prima iniezione: 0.4 mL; 0.8 s; 120 s. La prima iniezione deve avere un volume inferiore rispetto alle altre (nel nostro caso, 0.4 μL) e il picco corrispondente sarà scartato perché il calore osservato da questa prima iniezione è inaccurato e sistematicamente più basso del previsto.

• Altre iniezioni: 2.0 mL; 4.0 s; 120 s.

In questo tipo di esperimento, l'uso di ITC per la caratterizzazione del processo di micellizzazione è limitato a un intervallo di temperatura in cui si possono ottenere curve sigmoide. Il processo di auto-assemblaggio può essere correlato al rilascio o all'assorbimento di calore rilevabile. Il valore critico di concentrazione micellare (CMC) dovrebbe essere raggiunto nel mezzo della titolazione ITC per ottenere un profilo sigmoide migliore, il che indica una transizione netta dalla fase monomerica alla fase micellare.